調(diào)節(jié)外泌體膜膽固醇含量實(shí)現(xiàn)基于膜融合機(jī)制的siRNA胞質(zhì)遞送
外泌體的細(xì)胞攝取主要依賴于內(nèi)吞作用機(jī)制和內(nèi)溶酶體捕獲，其遞送的siRNA在酸性和酶促環(huán)境中極易降解，導(dǎo)致遞送效率偏低。近期發(fā)表于Nature Nanotechnology期刊的研究證明，增加外泌體膜中膽固醇含量可以使其通過膜融合機(jī)制被細(xì)胞攝取，可以規(guī)避上述siRNA降解現(xiàn)象，提高遞送效率。
【不同膽固醇含量外泌體的制備及理化表征】
天然牛奶外泌體中膽固醇含量約為18%（w%），該研究一方面使用甲基-β-環(huán)糊精（MeβCD）去除牛奶外泌體膜中的膽固醇（Chol）以降低其含量（見上圖），另一方面通過薄膜水合方法在牛奶外泌體膜中加入膽固醇以提高其含量，最終得到膽固醇含量分別為5%、10%、18%、23%和30%的工程化外泌體(以X%Chol/MEs表示，如下圖)。所有工程化外泌體的粒徑約為140 nm，ζ電位約為-12 mV。透射電鏡顯示隨著外泌體膜膽固醇含量的增加，外泌體杯狀形態(tài)逐漸模糊，脂膜增厚。冷凍電鏡結(jié)果顯示，所有工程化外泌體均呈球形且粒徑單分散性良好。工程化外泌體的彈性與膜內(nèi)膽固醇含量直接相關(guān)，隨著膜中膽固醇含量的增加，其剛性顯著降低。分子動力學(xué)模擬顯示，高膽固醇的外泌體膜會發(fā)生變形，增加其與細(xì)胞膜的接觸面積，最終促進(jìn)膜融合發(fā)生。
【高膽固醇外泌體的細(xì)胞攝取機(jī)制】
外泌體的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著膜膽固醇含量的增加，結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116對牛奶外泌體的攝取能力增加，其中30%Chol/MEs外泌體的攝取量分別是5%Chol/MEs、10%Chol/MEs、18%Chol/MEs和23%Chol/MEs 外泌體的4倍、3.5倍、2倍和1.6倍。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，30%Chol/MEs可以與HCT116癌細(xì)胞膜融合，而天然外泌體和脫膽固醇外泌體組未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。其中，5%Chol/MEs外泌體先附著在細(xì)胞膜上，然后被囊泡包裹，最終通過經(jīng)典內(nèi)吞作用被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。上述結(jié)果表明，高膽固醇外泌體的細(xì)胞攝取主要依賴于膜融合機(jī)制。
【高膽固醇外泌體的siRNA遞送和基因沉默效果】
以30%Chol/MEs外泌體遞送Cy3熒光標(biāo)記的siRNA發(fā)現(xiàn)，只有少量siRNA與溶酶體存在共定位，而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有清晰的共定位，表明其多數(shù)未被溶酶體捕獲。相比之下，5%Chol/MEs外泌體遞送的siRNA大部分與溶酶體存在共定位，極少數(shù)siRNA與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位。上述結(jié)果進(jìn)一步證明，30%Chol/MEs外泌體主要通過膜融合機(jī)制被細(xì)胞攝取，siRNA不經(jīng)過溶酶體可以直接釋至細(xì)胞質(zhì)中，使其能夠到達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以發(fā)揮功能。以PLK1-siRNA作為遞送藥物評價(jià)工程化外泌體對HCT116細(xì)胞中靶基因的沉默效率，結(jié)果顯示30%Chol/siPLK1外泌體組對PLK1 mRNA下調(diào)達(dá)到84.1%，PLK1蛋白水平下調(diào)約60%，且表現(xiàn)出顯著的增殖抑制和凋亡效應(yīng)?；谏鲜鼋Y(jié)果，研究人員認(rèn)為30%Chol工程化外泌體的遞送性能優(yōu)于市售的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和RNAiMAX等。
【高膽固醇外泌體遞送siRNA的抗腫瘤效果】
異位結(jié)直腸癌移植瘤模型的靜脈注射治療實(shí)驗(yàn)表明，PBS對照組小鼠腫瘤體積分別是30%Chol/siPLK1、18%Chol/siPLK1和5%Chol/siPLK1外泌體治療組的7.3倍、4.1倍和2.8倍，30%Chol/siPLK1組幾乎完全抑制了腫瘤生長。原位結(jié)直腸癌小鼠模型的口服給藥治療實(shí)驗(yàn)表明，Cy5.5標(biāo)記的siRNA與熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞具有顯著的共定位，表明工程化外泌體在口服給藥后24小時(shí)內(nèi)可以聚集在結(jié)腸并被結(jié)直腸癌細(xì)胞攝取。小鼠每天以100微克/公斤的給藥標(biāo)準(zhǔn)口服含siPLK1的工程化外泌體連續(xù)14天，治療期間小鼠體重?zé)o顯著變化，主要器官沒有觀察到顯著組織毒性，生物相容性良好。腫瘤生長監(jiān)測顯示(下圖），5%Chol/siPLK1（G1）和18%Chol/siPLK1（G2）治療組顯著抑制了腫瘤生長。30%Chol/siPLK1（G3）治療組腫瘤出現(xiàn)回縮，顯示出最強(qiáng)的抗腫瘤效果。
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